La movilidad restringida de grupos funcionales específicos reduce la anti

Jul 25, 2023

Scientific Reports volumen 6, Número de artículo: 22478 (2016) Citar este artículo

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Los tratamientos contra el cáncer más comunes actualmente disponibles son la radioterapia y la quimioterapia. Estas terapias tienen, sin embargo, inconvenientes, como la reducción de la calidad de vida y la baja eficacia de la radioterapia en casos de metástasis múltiples. Para disminuir estos efectos, hemos encapsulado un medicamento contra el cáncer en una matriz biocompatible. Los ensayos in vitro indican que este bionanocompuesto es capaz de interactuar y causar cambios morfológicos en las células cancerosas. Mientras tanto, no se observaron alteraciones en monocitos y fibroblastos, lo que indica que este sistema podría transportar el fármaco en organismos vivos con una tasa de eliminación y toxicidad reducidas. Se utilizaron rayos X y neutrones para investigar la estructura del transportador, así como para evaluar la movilidad del fármaco dentro del bionanocompuesto. A partir de estos datos únicos, mostramos que la restricción de la movilidad parcial de los grupos activos de la molécula del fármaco sugiere por qué este diseño de transportador es potencialmente más seguro para las células sanas.

El cáncer es uno de los principales problemas de salud pública a nivel mundial. En Europa, la incidencia de esta enfermedad ha pasado de 3,2 millones de nuevos casos en 2008 a 3,45 millones en 2012, con una mortalidad en torno al 50%1,2. El paclitaxel (PTX) es uno de los fármacos más efectivos actualmente disponibles para el tratamiento del cáncer de mama, pulmón y ovario3,4,5,6. Su función se basa en un mecanismo único que implica la estabilización de los microtúbulos celulares, lo que explica su éxito terapéutico7. Sin embargo, todavía existen limitaciones considerables con respecto a este fármaco, principalmente debido a su baja solubilidad en agua (~0.4 μg/mL) y, por supuesto, su toxicidad para las células sanas. Para aumentar su solubilidad, a menudo se formula un fármaco en disolventes orgánicos, como etanol deshidratado y aceite de ricino polioxietilado. Lamentablemente, este enfoque provoca muchos efectos secundarios, como reacciones de hipersensibilidad e hiperlipidemia8.

En consecuencia, el desarrollo o modificación de sistemas para acomodar y administrar medicamentos contra el cáncer es de suma importancia9. Una alternativa prometedora es el uso de nanoportadores poliméricos solubles para controlar la farmacocinética y la biodistribución del fármaco10. El biopolímero quitosano, en particular, ha despertado gran interés en aplicaciones biomédicas debido a su biocompatibilidad y biodegradabilidad11. Esta ruta también se ha utilizado como matriz de encapsulación para PTX con resultados prometedores12,13. Se pueden realizar mejoras adicionales modificando las características de la superficie del sistema de administración de fármacos con compuestos de baja toxicidad, lo que también puede hacer posible aumentar la adhesión del vehículo a las células cancerosas14. Para ello, el uso de la hidroxiapatita (Ca10(PO4)6(OH)2, en adelante HAP), principal constituyente inorgánico de los huesos y dientes humanos, es un excelente candidato. A escala nanométrica, HAP presenta especial biocompatibilidad así como no inmunogenicidad, comportamiento no inflamatorio, alta osteoconductividad y buena adhesión a diferentes tipos de células cancerosas15,16. Aún más interesante, las nanopartículas HAP (nHAP) muestran un efecto inhibitorio sobre la proliferación de células cancerosas con efectos menores sobre las sanas16,17,18,19. En consecuencia, la combinación de las propiedades de nHAP con biopolímeros en un nanocompuesto puede dar lugar a sistemas de administración de fármacos con efectos inherentes sobre las células cancerosas. Sin embargo, para aprovechar al máximo las propiedades de nHAP, estas nanopartículas deben estar en la capa exterior del compuesto20. Además de los beneficios derivados de la combinación de un biopolímero con nHAP, la inclusión de un fármaco en nanoportadores con propiedades magnéticas, por ejemplo, nanopartículas de ferrita de Mn-Zn, ofrece nuevas posibilidades notables. Por ejemplo, guiar el portador de la droga a lo largo del cuerpo utilizando un campo magnético externo, así como monitorear su posición mediante gradiómetros o imágenes de resonancia magnética21,22,23,24. Finalmente, los tratamientos de hipertermia magnética, que representan una técnica prometedora utilizada en combinación con radio y quimioterapia, también se vuelven practicables25,26,27.

Siguiendo las ideas descritas anteriormente, hemos encapsulado PTX en un bio-nanocompuesto (en adelante bio-NCP y bio-NCP + PTX) formado por nanopartículas de ferrita Mn-Zn recubiertas con quitosano, cuya superficie fue modificada con nHAP28.

Las pruebas morfológicas in vitro, realizadas mediante microscopía electrónica de barrido (SEM) y espectroscopía de rayos X de energía dispersiva (EDS), basadas en una metodología desarrollada por nuestro grupo, permitieron una visión preliminar de la interacción entre células y nanopartículas sin necesidad de marcadores fluorescentes o radiactivos en las nanopartículas. Los resultados sugirieron que los monocitos normales y dos tipos distintos de células tumorales interactúan de manera diferente con el bio-NCP. Si bien no se observó toxicidad en las células sanas, se detectaron cambios morfológicos principalmente en las células de cáncer de colon.

La caracterización bastante desafiante del bio-NCP + PTX formulado y la comprensión de la dinámica del fármaco encapsulado y liberado se lograron mediante el uso de técnicas avanzadas de microscopía y espectroscopia, respectivamente. Estos incluyen espectroscopía de estructura fina de absorción de rayos X cerca del borde (NEXAFS), microscopía de rayos X de transmisión de barrido (STXM) y dispersión de neutrones inelástica (INS).

NEXAFS permitió caracterizar diferentes grupos orgánicos gracias a la interacción de los rayos X con la capa K de los átomos de carbono, sin que las nanopartículas magnéticas afectaran el resultado29. Al combinar NEXAFS con STXM, se obtuvo el mapa de composición química junto con el análisis visual de la distribución de PTX del bio-NCP. Estos resultados indican que la PTX se distribuye dentro de la parte polimérica del vehículo.

Finalmente, la comparación de la dinámica del fármaco encapsulado con la de la forma pura, un paso clave para comprender y controlar las interacciones polímero/fármaco y una de las principales preguntas en el desarrollo posterior de esta tecnología hacia los ensayos clínicos, se obtuvo mediante combinando el INS con los cálculos de la Teoría Funcional de la Densidad (DFT). Estos resultados permitieron la asignación de los modos de vibración, incluidos los observados dentro del transportador del fármaco30,31,32. Usando este enfoque, mostramos que aunque los modos vibratorios de fenilo y acetilo están restringidos por la encapsulación, parecen recuperarse después de la liberación del fármaco. Esto es importante porque se sabe que la actividad de PTX está relacionada con la movilidad de estos grupos7.

Para concluir, el conjunto de nuestros resultados indica que el bio-NCP propuesto puede abrir nuevas oportunidades para el campo emergente de la administración de fármacos.

El potencial del bio-NCP como portador de PTX se destaca por las pruebas in vitro con monocitos, que tienden a promover la fagocitosis en partículas o moléculas extrañas en el cuerpo humano, impidiendo que lleguen a los tejidos diana.

Los cambios morfológicos de los monocitos de un donante sano (grupo de control) (Fig. 1 (a)) se evaluaron visualmente en respuesta a su contacto durante 2 h con las nanopartículas de ferrita pura (Fig. 1 (b)) y con el bio-NCP (Fig. 1(c)) por medio de SEM. En ambos casos, no se observaron cambios morfológicos considerables. Posteriormente, las células fueron analizadas por EDS para determinar regiones con alta concentración de Fe, componente principal de las nanopartículas de ferrita Mn-Zn que componen el núcleo del bio-NCP. Tal observación proporciona información sobre las interacciones entre las células y las nanopartículas. De hecho, este es el caso en el ensayo con ferrita Mn-Zn, donde se observaron células con alta concentración de Fe, marcadas en verde y resaltadas por las flechas en la micrografía SEM representativa, como se muestra en la Fig. 1 (b). Este escenario cambia al modificar las nanopartículas con el bio-NCP, donde las células presentan menor concentración de Fe después del ensayo como se muestra en la Fig. 1(c). Sugiriendo así que el recubrimiento biopolimérico modificado con nHAP inhibe la reacción de las células de defensa, lo que se sabe que compromete la función del transportador33.

Imágenes SEM representativas y análisis EDS de monocitos normales de un donante sano (grupo de control) (a) y las células después de estar en contacto durante 2 h con nanopartículas de ferrita Mn-Zn (b) o con el bio-NCP (c). Las altas concentraciones de Fe, marcadas en verde, sugieren la absorción de las nanopartículas de ferrita Mn-Zn.

La figura 2(a) presenta imágenes SEM representativas de grupos de control de células cancerosas de colon (arriba) y pulmón (abajo), mientras que la figura 2(bc) presenta las células después de 2 h de contacto con ferrita de Mn-Zn y nanopartículas de bio-NCP. respectivamente. Las células también se sometieron a análisis EDS como se muestra en los puntos verdes, que son más evidentes para las células analizadas con nanopartículas de ferrita Mn-Zn pura, Fig. 2 (b).

Imágenes SEM representativas y análisis EDS de análisis in vitro de células cancerosas de colon (HCT116) y pulmón (3LL) (control) (a) y las células después de 2 h de contacto con ferrita Mn-Zn (b) y bio-NCP (c ). Los puntos verdes representan regiones con alta concentración de Fe según lo determinado por EDS y los recuadros presentan imágenes ampliadas de las regiones seleccionadas. Las células de cáncer de colon presentan los cambios morfológicos más evidentes tras el contacto tanto con la ferrita Mn-Zn como con el bio-NCP.

Además, en cada figura, los recuadros muestran imágenes ampliadas de áreas seleccionadas para resaltar los cambios morfológicos celulares. Estos cambios se evaluaron comparando la distribución de la relación de aspecto de las células, que se refiere a la relación entre el eje mayor y el menor de una elipse que describe la forma de cada célula, antes y después de su contacto con la ferrita de Mn-Zn y la bio- Nanopartículas NCP. Bajo estas líneas, las distribuciones de relación de aspecto más cercanas a 1 indican celdas con formas predominantemente esféricas. Estos resultados se muestran en la Fig. 3. A partir de estos análisis se obtiene una relación de aspecto media de 1,9 y 1,5 para los grupos de control de colon y pulmón, respectivamente. Curiosamente, después del contacto entre las células de cáncer de colon y la ferrita de Mn-Zn y el bio-NCP, la distribución de la relación de aspecto de las células mostró una disminución de alrededor del 26 %, alcanzando un valor medio de 1,4. No se detectan cambios detectables para las células pulmonares.

Distribuciones de relación de aspecto representadas por barras para (a) células de control de cáncer de colon (HCT116) y pulmón (3LL) y para las células después de 2 h de contacto con (b) ferrita Mn-Zn y (c) bio-NCP. Los cambios morfológicos, más evidentes en las células de cáncer de colon después del contacto con la ferrita Mn-Zn y el bio-NCP, se reflejan en las distribuciones más nítidas. En cada figura, los símbolos representan la frecuencia acumulada de las relaciones de aspecto.

Finalmente, se proporcionó una prueba preliminar de citotoxicidad de los materiales, incluido el bio-NCP + PTX, a células sanas mediante ensayos in vitro con fibroblastos, adoptados aquí como modelo para células sanas, siguiendo la recomendación dada por ISO 10 993-5 . Como se presenta en la Fig. 4, la viabilidad de los fibroblastos después de los ensayos no presenta diferencias significativas en comparación con los resultados obtenidos para el grupo de control, lo que indica que no hay toxicidad significativa.

Ensayo de viabilidad sobre fibroblastos tras 24 h en contacto con las nanopartículas de ferrita de Mn-Zn, el bio-NCP y el complejo bio-NCP + PTX sin mostrar toxicidad significativa.

Tenga en cuenta que la muestra de control es el fibroblasto sin contacto con ningún material.

Los espectros NEXAFS para PTX y bio-NCP, presentados en la Fig. 5(a), se amplían por la convolución de las excitaciones debido a la considerable flexibilidad de los enlaces de carbono34. No obstante, la huella dactilar de PTX a 283,3 eV se detecta claramente y puede relacionarse con un enlace CC π*, que es característico de los anillos aromáticos. Un pico a 286 eV en el espectro de bio-NCP puede estar relacionado con una transición C1s → σ* en los enlaces C-OH, mientras que la banda ancha a 291 eV se asigna a la excitación de los enlaces C, H y N de los enlaces C-OH. quitosano reticulado34. El pico notable en el espectro bio-NCP a 347 eV está relacionado con el borde Ca L3,2 e indica la modificación de apatita en la superficie del quitosano35.

Espectros NEXAFS para PTX y bio-NCP (a). El espectro PTX muestra un pico característico a 283 eV, mientras que el espectro bio-NCP muestra transiciones características a 286 eV, 291 eV y 347 eV. En (b), el mapa de la composición química del bio-NCP + PTX obtenido por STXM tras realizar la descomposición en valores singulares sobre imágenes recogidas mediante rayos X con las siguientes energías: 275 eV, 283 eV, 286 eV, 300 eV, 320 eV y 347 eV. El PTX está representado en amarillo, el bio-NCP en rojo y el color azul corresponde a los materiales de fondo, incluidas las nanopartículas magnéticas. Los puntos verdes indican regiones con baja concentración de PTX. El mapa de composición muestra la distribución de la PTX en la cubierta polimérica de nHAP.

La Figura 5(b) presenta el mapa de composición química derivado de los datos STXM. En este mapa el PTX está representado en amarillo y el bio-NCP en rojo. El color azul representa los materiales de fondo, incluidas las nanopartículas magnéticas. Los puntos verdes, una mezcla de amarillo y azul, denotan regiones con baja concentración de PTX. La imagen resultante muestra que el fármaco se distribuye a lo largo de la cubierta de quitosano/nHAP con las nanopartículas magnéticas de ferrita Mn-Zn que forman el núcleo del bionanocompuesto. Esta distribución confirma el éxito de la encapsulación del fármaco.

Para verificar la recuperación de PTX después de la exposición del bio-NCP + PTX en medio acuoso por tiempos más prolongados, este último se dispersó en agua a 37 °C (temperatura del cuerpo humano) durante 7 días, se secó a temperatura ambiente al vacío y se investigó por FTIR. Todas las características espectrales específicas de la muestra dispersa, bio-NCP + PTX preparada y para la PTX pura se comparan con los resultados de los cálculos DFT para la molécula en fase gaseosa y se analizan en detalle en la información complementaria. El resultado más llamativo fue la observación de las modas situadas en 1535 y 1550 cm−1, asignadas a anillos de benceno. Estos modos se recuperan tras la liberación del fármaco y se relacionan con la actividad antitumoral de PTX7.

El siguiente punto clave para dilucidar el proceso de liberación fue el análisis de las interacciones del fármaco con su transportador. Este paso se logró combinando experimentos INS con cálculos DFT en la molécula libre. Los detalles sobre estos cálculos, asistidos con la identificación completa de las características vibratorias en los espectros mediante animaciones para el fármaco puro y encapsulado, se brindan en la información complementaria. Vale la pena notar que los cálculos se realizan en la aproximación armónica, mientras que los modos vibratorios de nuestros materiales, particularmente los de baja frecuencia, probablemente sean modos anarmónicos. La estructura esquemática de la molécula de PTX adaptada de 7 también se representa en la información complementaria.

En la Fig. 6(a), el máximo marcado alrededor de 56 cm−1 está relacionado con el modo acústico para H2O36. Aquí conviene recordar que la PTX utilizada en este trabajo es una mezcla de formas hidratadas y deshidratadas37. Los modos por encima de 60 cm−1 se asignan a los grupos acetilo y fenilo de la molécula de PTX y no se detectan en el espectro (bio-NCP + PTX-bio-NCP), que corresponde al de la molécula de PTX encapsulada. Esto indica que la molécula está severamente restringida o ha adaptado una nueva conformación. Sin embargo, también está claro, como muestran las flechas, que algunas vibraciones de frecuencias más altas asignadas a la molécula de PTX permanecen en el espectro (bio-NCP + PTX-bio-NCP). Estas vibraciones se originan principalmente en los carbonos del propio anillo de terpenos, así como en los movimientos de la red, lo que implica que la estructura rígida de la PTX se mantiene incluso después de la encapsulación. Como se muestra en la Fig. 6(b), las vibraciones de metilo restantes también se detectan entre 200 cm−1 y 270 cm−1, mientras que los modos por encima de 300 cm−1 parecen débiles debido a las malas estadísticas del procedimiento de sustracción. Por lo tanto, llegamos a la conclusión de que la restricción de los grupos acetilo y fenilo probablemente se deba al plegamiento de la molécula.

Datos del INS recopilados en FDS entre (a) 20 y 200 cm−1 y (b) entre 200 y 500 cm−1. En (a,b), la curva negra muestra los datos de PTX, mientras que la contribución del fármaco encapsulado, que se muestra en amarillo, se representa mediante el espectro de diferencia entre los espectros (bio-NCP + PTX) y (bio-NCP). Los datos bio-NCP no se muestran. Los espectros INS obtenidos por cálculos DFT para la molécula libre se muestran en verde. En el espectro de diferencias, los modos asignados a los grupos acetilo y fenilo, observados por debajo de 80 cm−1, no se detectan, mientras que las vibraciones del anillo terpénico, indicadas por flechas, permanecen visibles en el fármaco encapsulado. Esto indica que la movilidad de los grupos biológicamente activos de PTX está muy restringida.

Nuestros primeros ensayos in vitro muestran que no se observaron cambios morfológicos en los monocitos después de su contacto con las nanopartículas de ferrita Mn-Zn pura o con el bio-NCP. Sin embargo, después del contacto con la ferrita de Mn-Zn, varios monocitos presentaron una alta concentración de Fe. La última observación indica interacción y/o absorción de las nanopartículas magnéticas por los monocitos. Por su parte, se detectó una concentración de Fe muy baja en los ensayos realizados con el bio-NCP, lo que podría ser, en principio, consecuencia de la menor concentración de Fe en comparación con la ferrita pura. Sin embargo, dada la configuración de este experimento, descrito en la sección de métodos, es plausible considerar que el bio-NCP inhibe la interacción/absorción de los monocitos. Otros ensayos in vitro realizados con células de cáncer de colon y pulmón indican que tanto las nanopartículas de ferrita Mn-Zn como el bio-NCP interactúan y provocan cambios morfológicos en las células cancerosas, especialmente en las del colon. Esta suposición se basa en la variación de la distribución de la relación de aspecto, que inicialmente era característica de las celdas alargadas y se volvió más cercana a la que describe las esféricas después de la interacción. Incluso en una etapa temprana, este es un resultado alentador, ya que la invasividad de las líneas celulares de cáncer de colon se ha asociado con su morfología alargada38. Además, dado que la respuesta observada tanto para las nanopartículas de ferrita de Mn-Zn como para el bio-NCP es muy similar, es razonable suponer que el efecto del bio-NCP tiene su origen en el núcleo magnético. De hecho, los efectos de las nanopartículas a base de Fe en las células cancerosas, incluidas las del colon, se han atribuido a especies reactivas de oxígeno (ROS) catalizadas por Fe controladas que potencialmente desencadenan la autofagia y la muerte celular asociada39,40. En consecuencia, esta observación parece sugerir que los iones Fe se liberan a través de la cubierta de polímero/apatita del bio-NCP durante este experimento en particular. Por otro lado, la falta de toxicidad para los fibroblastos puede estar relacionada con la reducción de la toxicidad del Fe para las células sanas a bajas concentraciones de Fe41,42. Estos son resultados motivadores para la aplicación del bio-NCP + PTX en el tratamiento del cáncer, ya que parece no ser tóxico para las células sanas. Sin embargo, estos resultados también sugieren que el fármaco se encuentra en una concentración muy baja en el nanocompuesto o no se libera fácilmente en las condiciones experimentales del protocolo elegido. Para responder a esta pregunta es necesario investigar la concentración de PTX en el bio-NCP. Una tarea nada sencilla debido a la complejidad del bio-NCP + PTX, que dificulta la aplicación de las técnicas más comunes, como la HPLC (cromatografía líquida de alta resolución), y crea la necesidad de utilizar sistemas de estado sólido más sofisticados. enfoques. Por tanto, al combinar NEXAFS y STXM se obtuvo un mapa de la composición química para el bio-NCP + PTX. Este mapa muestra que una cantidad significativa del fármaco se distribuye dentro del quitosano y la capa de nHAP, lo que sugiere que la liberación lenta de PTX probablemente se deba a su confinamiento en la matriz.

Esta última observación nos señaló la necesidad de comprender cómo el confinamiento influye en la dinámica del PTX. Esta pregunta se respondió combinando INS y DFT. La simplicidad de la interacción neutrón-núcleo y la sección transversal de dispersión incoherente excepcionalmente alta del átomo de hidrógeno en comparación con la de cualquier otro elemento fueron claves para tal comprensión43. A partir de dicho análisis concluimos que la movilidad de los grupos biológicamente activos de PTX, es decir, los grupos acetilo y fenilo, están muy limitadas en el bio-NCP + PTX. Por lo tanto, se puede plantear la hipótesis de que el transportador limita la actividad de la PTX no solo como una barrera física entre el fármaco y los sitios de acción, sino también al restringir los movimientos en partes específicas de la molécula. Sin embargo, después de la liberación, estos movimientos vibratorios se recuperaron parcialmente, como se observó por medio de FTIR, lo que indica que el agente anticancerígeno podría recuperar su forma activa.

A partir de los resultados de viabilidad y del INS, ahora está claro que antes de contemplar futuras aplicaciones de bio-NCP + PTX en ensayos in vivo, la tasa de liberación del fármaco debe controlarse mejor. Un enfoque obvio para sortear el problema sería la modificación de la estructura del bio-NCP, es decir, el grado de reticulación y mimetización sobre el quitosano, o incluso la elección de otro polímero con una distribución de carga superficial diferente, como el polietilenglicol44 . No obstante, antes de avanzar en esta dirección, es necesario considerar algunas cuestiones, como la evaluación del comportamiento de liberación de PTX del bio-NCP en el entorno de las células cancerosas. El entorno de pH ligeramente más bajo inherente en comparación con el de las células sanas podría ser suficiente para degradar o relajar la red de quitosano45,46. Además, se debería investigar el uso de la radiofrecuencia como otra posibilidad. En este caso, al calentar las nanopartículas magnéticas27 se puede relajar la red polimérica y a su vez se podría facilitar la liberación del fármaco.

En conclusión, informamos sobre resultados alentadores en la aplicación de un nuevo bio-NCP como portador de PTX. También proponemos nuevas metodologías para el estudio de fármacos encapsulados, basadas en técnicas de dispersión de última generación combinadas con cálculos teóricos. Los próximos pasos de este trabajo se centrarán en comprender mejor los efectos de la encapsulación en la dinámica de la PTX liberada y su correlación con su actividad biológica, así como en la optimización del mecanismo de liberación del fármaco.

El proceso de síntesis detallado para obtener el bio-NCP se describe en otra parte28. Brevemente, a partir de los resultados de difracción de neutrones28, determinamos que 0.41 mg de Fe por mg de nanopartículas fueron precipitadas de una solución de sales y posteriormente encapsuladas en quitosano por el método de doble emulsión. Luego, el quitosano se entrecruzó por reacción con glutaraldehído y se realizó un proceso de mimetización final para modificar la superficie con apatito formando el nanocompuesto bio-NCP. Dependiendo de la eficiencia de mimetización, que no es fácil de determinar ya que está relacionada con la cantidad de apatito efectivamente presente en la superficie del polímero, en el bio-NCP final la cantidad de Fe por mg puede variar entre 0,20 mg (100% de eficiencia) y 0,27 mg (0% de eficacia). El bio-NCP + PTX se produjo mediante un método similar que incluía agregar PTX a la solución antes de la reticulación del quitosano. Por lo tanto, podemos suponer que la cantidad de contenido de Fe en el bio-NCP + PTX es similar. Se dan más detalles en la información complementaria.

Se aislaron monocitos humanos de sangre periférica de donantes sanos de acuerdo con la Declaración de Helsinki. Todos los voluntarios sanos dieron su consentimiento informado. El estudio fue aprobado por el Comité de Ética en Investigación en Salud, Plataforma Brasil (http://aplicacao.saude.gov.br/plataformabrasil/login.jsf), con número de decisión 1358038 y número de CAAE 50995715.9.0000.5411. Se utilizaron líneas celulares de cáncer estables proporcionadas por el laboratorio del Dr. Kaneno. Por lo tanto, no se requirió la aprobación del comité de ética local. Los procesos detallados involucrados en la preparación de cultivos celulares se describen en la información complementaria. Después de la preparación, las células se ajustaron a 2 × 105 células/mL y se distribuyeron en portaobjetos de vidrio redondeados (∅13 mm), previamente recubiertos con poli-L-lisina. Para promover la unión celular en los portaobjetos, los cultivos se mantuvieron durante 2 horas a 37 °C bajo 5% de CO2.

Los portaobjetos de vidrio se lavaron tres veces con medio de cultivo completo tibio (descrito en la información complementaria) (1 ml cada vez) y se les permitió interactuar con 50 μg de ferrita pura o nanopartículas bio-NCP. Los cultivos celulares se mantuvieron durante 2 h a 37 °C bajo 5 % de CO2 para permitir el contacto directo entre las superficies celulares y las nanopartículas. A continuación, los portaobjetos se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (PBS) fresca a temperatura ambiente, las monocapas de células se fijaron con glutaraldehído al 2,5 % y se procesaron rutinariamente para análisis microscópicos como sigue.

Después de la fijación de las monocapas en los portaobjetos, las células se deshidrataron con soluciones de etanol al 7,5, 15, 30, 50, 70, 90 y 100 %, dos veces en 10 min para cada concentración de alcohol y se sometieron a secado supercrítico (sobre el punto crítico). ) en una atmósfera de CO2 para su posterior metalización. Posteriormente, las muestras se analizaron con microscopía electrónica de barrido (SEM) (FEI, Quanta 200 equipado con un Oxford, Inca, 250P20 EDS) y se recolectaron aleatoriamente 7 imágenes (aumento de 1000 ×) para cada portaobjetos. Las distribuciones de la relación de aspecto de las celdas se evaluaron con el software ImagePro 4.1.0.0. No se realizó ningún estudio para determinar el número de células; por lo tanto, los recuentos de células se normalizaron al valor máximo. Se usó EDS para mapear la concentración de Fe sobre las células. La cantidad de nanopartículas, así como los parámetros del instrumento, se configuraron para proporcionar la misma relación señal/ruido para una misma masa de ferrita Mn-Zn o bio-NCP.

La toxicidad de la ferrita pura, bio-NCP y bio-NCP + PTX se evaluó con respecto a los fibroblastos Balb/c 3T3 (clon A31–American Type Culture Collection) de la siguiente manera. En primer lugar, las células se procesaron como se describe en la información complementaria, se dispensaron en placas de 96 pocillos, cada una con 5 × 104 células y se mantuvieron en cultivo durante 24 h. Posteriormente, 50 μg de cada muestra, es decir, ferrita pura, bio-NCP y bio-NCP + PTX, se suspendieron en los mismos medios de cultivo utilizados para cultivar las células y se agregaron a las placas para permitir su interacción con las células. Después de 24 h, se eliminó el sobrenadante, es decir, el exceso de líquido y nanopartículas magnéticas, las células se lavaron con PBS-A y se sometieron a incubación con 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) con 0,5 mg de MTT/mL de DMEM durante 4 horas. Esto dio como resultado la formación del colorante de formazán en las células vivas, que se solubilizó en DMSO y se cuantificó utilizando un fotómetro de microplacas mediante la lectura a 570 nm. Los valores de absorbancia obtenidos reflejan la viabilidad de las células. Los experimentos se realizaron por duplicado con an = 6 cada uno.

Las muestras de PTX y bio-NCP se dispersaron en etanol para depositarlas en membranas de nitruro de silicio (Silson, Inglaterra) y se colocaron en un entorno de bajo vacío para el análisis de rayos X utilizando el rango de energía de fotones de borde K de carbono (250 a 350 eV) a la línea de haz PolLux (fuente de luz suiza en el Instituto Paul Scherrer, Suiza)47,48,49. Para los experimentos STXM, un haz de rayos X monocromático se enfoca en la muestra y la intensidad transmitida medida se usa para construir una imagen píxel por píxel. Al ajustar la energía de los fotones de rayos X a las características de resonancia presentes en el espectro NEXAFS, las imágenes STXM mostrarán características fuertes que están relacionadas con el contraste natural basado en la unión molecular de los materiales constituyentes. Por lo tanto, al combinar un conjunto de imágenes obtenidas a energías fotónicas seleccionadas con los espectros NEXAFS de los materiales componentes, el mapa de composición química de la muestra se calcula utilizando la descomposición de valores singulares50. Por lo tanto, después de recolectar los espectros NEXAFS del PTX y del bio-NCP, se obtuvieron imágenes STXM para el bio-NCP + PTX a energías de rayos X de: 275 eV, 283 eV, 286 eV, 300 eV, 320 eV y 347 eV. Las imágenes y los espectros se analizaron utilizando el paquete de software aXis200051.

La dinámica vibratoria de PTX, bio-NCP y bio-NCP + PTX se investigó mediante espectroscopía de neutrones utilizando el espectrómetro FDS en el Centro Lujan del Laboratorio Nacional de Los Álamos (EE.UU.) a 10 K. Mediante el uso de este espectrómetro fue posible para observar movimientos moleculares entre 50 y 500 cm−1. Las muestras se montaron en recipientes de aluminio sellados y se usó una corrida de vanadio para corregir los datos.

La optimización estructural de la molécula de paclitaxel en fase gaseosa a 0 K y el cálculo posterior de las frecuencias vibratorias armónicas se llevaron a cabo en el nivel de teoría B3LYP/6-31 + G(d′) usando Gaussian0952. Las posiciones atómicas iniciales se tomaron de la estructura cristalina del 2-carbamato taxol, descrita en la ref. 53. Las frecuencias y amplitudes vibratorias del cálculo gaussiano se usaron luego para calcular las intensidades y los espectros vibratorios de los espectros de dispersión de neutrones inelásticos usando el programa a_climax54. El espectro FTIR para el PTX también se calculó y utilizó para la asignación de modo en el rango de 1400 a 1900 cm−1.

Cómo citar este artículo: Martins, ML et al. La movilidad restringida de grupos funcionales específicos reduce la actividad de los fármacos contra el cáncer en las células sanas. ciencia Rep. 6, 22478; doi: 10.1038/srep22478 (2016).

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Este trabajo se ha beneficiado del uso del Centro de Dispersión de Neutrones Manuel Lujan, Jr. en el Laboratorio Nacional de Los Álamos y el financiamiento de la Oficina de Ciencias Energéticas Básicas del Departamento de Energía. El Laboratorio Nacional de Los Alamos (LANL) es operado por Los Alamos National Security LLC bajo el contrato DOE DE-AC52-06NA25396. MLM y RI agradecen a Swiss Light Source por el tiempo de haz en PolLux, que es financiado por el Ministerio alemán de Bildung und Forschung (BMBF) a través de los contratos 05KS4WE1/6 y 05KS7WE1. Los autores agradecen a FAPESP, CNPq y DANSCATT por el apoyo financiero. JE quisiera agradecer al Grupo de Física y Química de Materiales (T-1) en LANL por poner a disposición los recursos informáticos y al Dr. Jernej Stare por realizar algunos cálculos en el Instituto Nacional de Química, Ljubljana, Eslovenia. También se agradece al Dr. Walter Kalceff (UTS, Australia) por la revisión crítica y los debates de este trabajo.

Instituto Niels Bohr, Universidad de Copenhague, DK-2100, Copenhague, Dinamarca

Murillo L. Martins, Rosanna Ignazzi & Heloisa N. Bordallo

Instituto de Biociencias - Universidad Estadual Paulista – CP 510, 18618-970, Botucatu–SP, Brasil

Murillo L. Martins, Ramón Kaneno, Willian F. Zambuzzi y Margaret J. Saeki

Departamento de Química, Universidad del Sur de Florida, 4202 E. Fowler Ave., Tampa, 33620, Florida, Estados Unidos de América

Jürgen Eckert

Laboratorio Nacional de Los Álamos, Los Álamos, 87545, Nuevo México, Estados Unidos de América

Juergen Eckert y Luke Daemen

Fuente de luz suiza, Instituto Paul Scherrer, CH-5232, Villigen, Suiza

benjamin watts

Fuente europea de espalación ESS AB, PO Box 176, SE-221 00, Lund, Suecia

Heloisa N. Bordallo

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MLM y HNB participaron en el diseño de los experimentos, análisis de datos y redacción del manuscrito. MLM, RI, BW, RK, WFZ, LD y MJS realizaron los experimentos y la reducción de datos. JE proporcionó experiencia con los cálculos de DFT. Este manuscrito fue aprobado por todos los coautores en su versión actual.

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.

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Reimpresiones y permisos

Martins, M., Ignazzi, R., Eckert, J. et al. La movilidad restringida de grupos funcionales específicos reduce la actividad de los fármacos contra el cáncer en las células sanas. Informe científico 6, 22478 (2016). https://doi.org/10.1038/srep22478

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Recibido: 29 junio 2015

Aceptado: 08 febrero 2016

Publicado: 02 marzo 2016

DOI: https://doi.org/10.1038/srep22478

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